Ознакомление с микроскопированием мазков.
Для изучения морфологии микроорганизмов используют микроскопы. Биологический микроскоп (рис. 1) представляет собой оптический прибор, увеличивающий предметы в 1000-15000 раз, и состоит из механической, оптической и осветительной систем.
К механической системе относятся подковообразная ножка, тубусодержатель, тубус, предметный столик, винты. Оптическая система включает объективы и окуляр. Осветительная система состоит из конденсора с диафрагмой и зеркала.
Тубусодержатель и подковообразное основание (ножка) соединены между собой подвижно шарниром. Тубус - зрительная труба микроскопа. В верхнюю часть тубуса вставлен окуляр, в нижнюю - вращающийся вокруг своей оси револьвер, в который ввинчены объективы. Тубус передвигается вверх и вниз при помощи макрометрического и микрометрического винтов. Один оборот микрометрического винта передвигает тубус на 0,1 мм. Поэтому микровинтом пользуются для более точной наводки, а для предварительной - макровинтом. Предметный столик предназначен для размещения исследуемого материала. Столик можно передвигать в различных направлениях с помощью винтов.
Конденсор состоит из линз, собирающих отраженные от зеркала лучи в сильный световой пучок, и направляет его через отверстие предметного столика на препарат. При определении подвижности неокрашенных препаратов конденсор должен быть несколько опущен.
Диафрагма находится между зеркалом и конденсором и служит для регулирования количества света, поступающего в конденсор.
Объектив состоит из системы линз, заключенных в металлическую оправу. Передняя линза служит для увеличения предмета, остальные - для коррекции изображения. Объектив дает действительное, увеличенное, обратное изображение.
Современные биологические микроскопы имеют не менее трех объективов. Сухие объективы увеличивают в 8 и 40 раз (между объективами и препаратом находится слой воздуха), иммерсионные - в 90 раз. На оправу каждого объектива нанесена цифра, указывающая увеличение. При микроскопии окрашенных препаратов пользуются иммерсионным объективом, погружая переднюю линзу в каплю кедрового масла, нанесенного на предметное стекло с окрашенными бактериями. Благодаря этому все лучи от осветителя, не изменяя своего направления, попадают в объектив и получается четкое изображение.
Окуляр состоит из верхней - глазной и нижней - собирательной линз. На верхней части окуляра имеется цифра, указывающая увеличение (7, 10, 15). Окуляр увеличивает только изображение. Общее увеличение микроскопа складывается из произведения увеличения объектива на увеличение окуляра.
Принцип действия люминесцентного микроскопа основан на способности отдельных объектов и красителей светиться при освещении их ультрафиолетовыми лучами. Люминесцентные микроскопы снабжены источником ультрафиолетового света и набором светофильтров. У бактерий очень слабо выражена собственная флюоресценция. Поэтому необходимо их обработать флюоресцирующими красками (флюорохромами), которые окрашивают структурные" элементы клетки в различные цвета.
Принцип действия электронного микроскопа основан на использовании вместо световых лучей потока электронов, получаемых из электронной пушки. Все оптические линзы заменены электромагнитными катушками, создающими электромагнитное поле, которое управляет движением электронов. Электронный микроскоп увеличивает предмет в 50-200 тыс. раз. Препараты для исследования готовят на тонких пленках коллодия. На пути потока электронов ставят исследуемый объект, который отражается на люминесцирующем экране. Изображение объекта можно сфотографировать аппаратом, вмонтированным в микроскоп. С помощью электронной микроскопии можно детально изучать строение бактерий, вирусов, бактериофага.
Рабочий стол для микроскопирования препаратов желательно размещать у окна. Микроскоп устанавливают на рабочий стол тубусодержателем к себе примерно на 7-10 см от края. Вначале проводят настройку освещения, для чего зеркалом направляют пучок света от источника освещения в объектив с увеличением в 8 раз.
При правильной настройке освещения поле зрения микроскопа должно быть в виде равномерно освещенного круга. После этого на предметный столик помещают исследуемый препарат, который закрепляют клеммами и рассматривают под микроскопом, пользуясь объективами с увеличением в 8, 40 или 90 раз.
При работе с объективами 8 и 40 тубус микроскопа осторожно опускают с помощью макрометрического винта, приближают объектив почти вплотную к препарату, но не касаются его. Наблюдают в окуляр, слегка приподнимая тубус тем же винтом до получения изображения. С помощью микрометрического винта проводят точную установку объектива до получения четкого изображения предмета.
При работе с иммерсионным объективом (увеличение в 90 раз) на препарат предварительно наносят каплю иммерсионного масла, а затем под контролем глаза макрометрическим винтом опускают объектив в каплю масла. Точную установку препарата в фокус объектива проводят с помощью микрометрического винта, который можно вращать на пол-оборота.
По окончании работы исследуемый материал снимают с предметного столика. Мягкой тканью, смоченной в спирте или эфире, удаляют иммерсионное масло с объектива, слегка опускают конденсор, устанавливают объектив и убирают микроскоп в футляр или хранят его под стеклянным колпаком, предохраняющим его от пыли и сырости.
Микроскоп - это оптический прибор, позволяющий получить обратное изображение изучаемого объекта и рассмотреть мелкие детали его строения, размеры которых лежат за пределами разрешающей способности глаза.
Разрешающая способность микроскопа дает раздельное изображение двух близких друг другу линий. Невооруженный человеческий глаз имеет разрешающую способность около 1/10 мм или 100 мкм. Лучший световой микроскоп примерно в 500 раз улучшает возможность человеческого глаза, т. е. его разрешающая способность составляет около 0,2 мкм или 200 нм.
Разрешающая способность и увеличение не одно и тоже. Если с помощью светового микроскопа получить фотографии двух линий, расположенных на расстоянии менее 0,2 мкм, то, как бы не увеличивать изображение, линии будут сливаться в одну. Можно получить большое увеличение, но не улучшить его разрешение.
Различают полезное и бесполезное увеличения . Под полезным понимают такое увеличение наблюдаемого объекта, при котором можно выявить новые детали его строения. Бесполезное - это увеличение, при котором, увеличивая объект в сотни и более раз, нельзя обнаружить новых деталей строения. Например, если изображение, полученное с помощью микроскопа, увеличить еще во много раз, спроецировав его на экран, то новые, более тонкие детали строения при этом не выявятся, а лишь соответственно увеличатся размеры имеющихся структур.
В учебных лабораториях обычно используют световые микроскопы , на которых микропрепараты рассматриваются с использованием естественного или искусственного света. Наиболее распространены световые биологические микроскопы: БИОЛАМ, МИКМЕД, МБР (микроскоп биологический рабочий), МБИ (микроскоп биологический исследовательский) и МБС (микроскоп биологический стереоскопический). Они дают увеличение в пределах от 56 до 1350 раз. Стереомикроскоп (МБС) обеспечивает подлинно объемное восприятие микрообъекта и увеличивает от 3,5 до 88 раз.
В микроскопе выделяют две системы: оптическую и механическую. К оптической системе относят объективы, окуляры и осветительное устройство (конденсор с диафрагмой и светофильтром, зеркало или электроосветитель).
Устройство световых микроскопов изображено на рис. 1.
Рис. 1. Устройство световых микроскопов:
А - МИКМЕД-1; Б - БИОЛАМ.
1 - окуляр, 2 - тубус, 3 - тубусодержатель, 4 - винт грубой наводки, 5 - микрометренный винт, 6 - подставка, 7 - зеркало, 8 - конденсор, ирисовая диафрагма и светофильтр, 9 - предметный столик, 10 - револьверное устройство, 11 - объектив, 12 - корпус коллекторной линзы, 13 - патрон с лампой, 14 - источник электропитания.
Объектив - одна из важнейших частей микроскопа, поскольку он определяет полезное увеличение объекта. Объектив состоит из металлического цилиндра с вмонтированными в него линзами, число которых может быть различным. Увеличение объектива обозначено на нем цифрами. В учебных целях используют обычно объективы х8 и х40. Качество объектива определяет его разрешающая способность.
Окуляр устроен намного проще объектива. Он состоит из 2-3 линз, вмонтированных в металлический цилиндр. Между линзами расположена постоянная диафрагма, определяющая границы поля зрения. Нижняя линза фокусирует изображение объекта, построенное объективом в плоскости диафрагмы, а верхняя служит непосредственно для наблюдения. Увеличение окуляров обозначено на них цифрами: х7, х10, х15. Окуляры не выявляют новых деталей строения, и в этом отношении их увеличение бесполезно . Таким образом, окуляр, подобно лупе, дает прямое, мнимое, увеличенное изображение наблюдаемого объекта, построенное объективом.
Для определения общего увеличения микроскопа следует умножить увеличение объектива на увеличение окуляра.
Осветительное устройство состоит из зеркала или электроосветителя, конденсора с ирисовой диафрагмой и светофильтром, расположенных под предметным столиком. Они предназначены для освещения объекта пучком света.
Зеркало служит для направления света через конденсор и отверстие предметного столика на объект. Оно имеет две поверхности: плоскую и вогнутую. В лабораториях с рассеянным светом используют вогнутое зеркало.
Электроосветитель устанавливается под конденсором в гнездо подставки.
Конденсор состоит из 2-3 линз, вставленных в металлический цилиндр. При подъеме или опускании его с помощью специального винта соответственно конденсируется или рассеивается свет, падающий от зеркала на объект.
Ирисовая диафрагма расположена между зеркалом и конденсором. Она служит для изменения диаметра светового потока, направляемого зеркалом через конденсор на объект, в соответствии с диаметром фронтальной линзы объектива и состоит из тонких металлических пластинок. С помощью рычажка их можно то соединить, полностью закрывая нижнюю линзу конденсора, то развести, увеличивая поток света.
Кольцо с матовым стеклом или светофильтром уменьшает освещенность объекта. Оно расположено под диафрагмой и передвигается в горизонтальной плоскости.
Механическая система микроскопа состоит из подставки, коробки с микрометренным механизмом и микрометренным винтом, тубуса, тубусодержателя, винта грубой наводки, кронштейна конденсора, винта перемещения конденсора, револьвера, предметного столика.
Подставка - это основание микроскопа.
Коробка с микрометренным механизмом , построенном на принципе взаимодействующих шестерен, прикреплена к подставке неподвижно. Микрометренный винт служит для незначительного перемещения тубусодержателя, а, следовательно, и объектива на расстояния, измеряемые микрометрами. Полный оборот микрометренного винта передвигает тубусодержатель на 100 мкм, а поворот на одно деление опускает или поднимает тубусодержатель на 2 мкм. Во избежание порчи микрометренного механизма разрешается крутить микрометренный винт в одну сторону не более чем на половину оборота .
Тубус или трубка - цилиндр, в который сверху вставляют окуляры. Тубус подвижно соединен с головкой тубусодержателя, его фиксируют стопорным винтом в определенном положении. Ослабив стопорный винт, тубус можно снять.
Револьвер предназначен для быстрой смены объективов, которые ввинчиваются в его гнезда. Центрированное положение объектива обеспечивает защелка, расположенная внутри револьвера.
Винт грубой наводки используют для значительного перемещения тубусодержателя, а, следовательно, и объектива с целью фокусировки объекта при малом увеличении.
Предметный столик предназначен для расположения на нем препарата. В середине столика имеется круглое отверстие, в которое входит фронтальная линза конденсора. На столике имеются две пружинистые клеммы - зажимы, закрепляющие препарат.
Кронштейн конденсора подвижно присоединен к коробке микрометренного механизма. Его можно поднять или опустить при помощи винта, вращающего зубчатое колесо, входящее в пазы рейки с гребенчатой нарезкой.
Для обнаружения и исследования микроорганизмов применяют световые микроскопы разных моделей («МБИ-1», «Биолам», «Бимам», «Микмед»). Для изучения более мелких объектов (вирусов) используют электронные микроскопы.
Все микроскопы устроены одинаково и состоят из механической части и оптической системы. Механическая часть состоит из основания штатива (1), предметного столика (2), тубусодержателя (3), револьвера объектива (4), макровинта (5) - для перемещения тубуса, микровинта (6) – для тонкой фокусировки. Оптическая часть микроскопа состоит из объективов (7), окуляров (8) и осветительного устройства (9). Объективы представляют собой систему линз, одна из которых производит увеличение, а все остальные корригируют изображение. Окуляры состоят из двух линз (собирающей и глазной). Они увеличивают изображение, получаемое с помощью объектива. Осветительное устройство (зеркало, ирис-диафрагма и конденсор).
1. Препарат помещают на предметный столик микроскопа и закрепляют его боковыми зажимами.
2. Вращая револьвер, устанавливают объектив малого увеличения 8х.
3. Находят правильное освещение препарата. Для этого, пользуясь плоским зеркалом, или светильником направляют свет от источника в конденсор микроскопа, стремясь получить равномерное освещение поля зрения. Лучшее освещение подбирают поднятием или опусканием конденсора и при помощи диафрагмы.
4. Находят изображение при малом увеличении (объектив 8х), фокусируя макрометрическим винтом.
5. Без поднятия тубуса, вращая револьвер, заменяют объектив малого увеличения на объективы большого увеличения (40х, 90х).
6. При использовании иммерсионного объектива (90х) открывают диафрагму конденсора, чтобы увеличить свет. На препарат наносят каплю иммерсионного (кедрового) масла. Затем, глядя на препарат сбоку (для контроля, чтобы не раздавить стекло и не поцарапать фронтальную линзу объектива), очень осторожно погружают объектив 90х в масло почти до соприкосновения с поверхностью стекла, работая макрометрическим винтом. Далее очень медленно поднимают тубус при помощи макровинта до появления в поле зрения изучаемого объекта. Наконец, резкость изображения устанвливают микрометрическим винтом.
При микроскопии в темном поле лучи, освещающие объект не попадают в объектив микроскопа, поле зрения остается темным, а объект на его фоне кажется светящимся. Эффект темного поля создается при помощи специального конденсора.
С помощью фазово-контрастной микроскопии могут быть исследованы без предварительной обработки бесцветные, прозрачные объекты. Для работы по методу фазового контраста, нужно кроме обычного биологического микроскопа, иметь еще специальное устройство. Для этого конденсор и объектив заменяют фазовыми. Фазовый конденсор поворотом револьверного диска устанавливают на 0. Это положение соответствует светопольному конденсору.
Современный микроскоп – это точный оптический прибор, требующий строгого соблюдения ряда правил при работе с ним. Хранить микроскоп нужно закрытым от пыли (под чехлом или под специальным стеклянным колпаком). Время от времени следует проверять чистоту и состояние оптики и протирать ее только снаружи с помощью волосяной кисточки или мягкой ткани, смоченной спиртом. Раз в год микроскоп должен просмотреть и при необходимости отремонтировать мастер-оптик.
Лабораторная работа № 1
Наименование практических работ, методика последовательности их выполнения
Матрица компетенций
Таблица 3 – Матрица формирования компетенций
| № п/п | Наименование темы | Компетенции, формируемые на занятиях | ||||
| ПК-7 | ПК-10 | ПК-12 | ПК-13 | ПК-31 | ||
| Устройство микроскопа. Техника микроскопирования. Морфология бактерий | * | * | ||||
| Морфологические свойства плесневых грибов. Морфология дрожжей и приготовление препарата ” Раздавленная капля” | * | * | * | |||
| Культуральные свойства микроорганизмов. | * | * | * | |||
| Методы подавления жизнедеятельности микроорганизмов, вызывающих порчу пищевых продуктов | * | * | * | * | ||
| Микрофлора мяса и мясных продуктов | * | * | * | |||
| Микрофлора плодов и овощей. Виды микробной порчи плодов и овощей, характеристика возбудителей | * | * | * | |||
| Микрофлора зерна, муки, крупы, хлебобулочных изделий. Различные виды порчи хлебобулочных изделий. | * | * | * | |||
| Микрофлора жиров и масел | * | * |
Профессиональные компетенции:
Уметь использовать технические средства для измерения основных параметров технологических процессов, свойств сырья, полуфабрикатов и качество готовой продукции, организовать и осуществлять технологический процесс производства продукции питания (ПК-7);
Устанавливать и определять приоритеты в сфере производства продукции питания, готовность обосновывать принятие конкретного технического решения при разработке новых технологических процессов производства продукции питания, выбирать технические средства и технологии с учетом экологических последствий их применения (ПК-10);
Организовывать документооборот по производству на предприятии питания, способностью использовать нормативную, техническую и технологическую документацию в условиях производства продукции питания (ПК-12);
Анализировать и оценивать результативность системы контроля деятельности производства; осуществлять поиск, выбор и использование новой информации в области развития индустрии питания и гостеприимства (ПК-13);
Способностью изучать и анализировать научно-техническую информацию, отечественный и зарубежный опыт по производству продуктов питания (ПК-31).
Цель занятия : Изучить устройство биологического микроскопа, освоить современные методы микроскопирования, изучить морфологические свойства бактерий.
Формирование:
Знания : морфология бактерий, этапы приготовления окрашенных припаратов, простые и сложные методы окраски, окраска по Граму.
Умения : просмотреть демонстрационные препараты, представляющие основные формы бактерий.
Владения : владение современными методами микроскопирования, приготовление фиксированных окрашенных препаратов.
Самостоятельная подготовка к занятию : изучить тему практической работы по литературным источникам и подготовить ответы на следующие вопросы.
1. общие закономерности в структуре клетки микроорганизмов, жизнедеятельности и условия их развития?
2. особенности химического состава микроорганизмов?
3. метаболизм микробной клетки?
Исследуемые материалы: красители, питательные среды.
Оборудование: микроскоп, посуда
Ход работы: Для изучения морфологических признаков разных групп микроорганизмов в производственных лабораторных исследованиях пользуются оптическим микроскопом. Современными моделями биологического микроскопа являются микроскопы серии «Биолам».
Микроскопирование является обязательным приемом при повседневном санитарно-бактериологическом контроле на предприятиях, связанных с производством и хранением пищевых продуктов, а также веществ и препаратов микробиологического синтеза (ферментов, витаминов и др.). Микроскопированием определяют чистоту культур промышленных микроорганизмов, изменения их количественного и качественного (группового или видового) состава по ходу процесса производства.
При помощи микроскопирования выявляют постороннюю микрофлору в сырье, полуфабрикатах, готовой продукции, на технологическом оборудовании, мешающую нормальному ходу процесса производства. Выявление нежелательной микрофлоры является сигналом для своевременной санитарной обработки оборудования и других объектов, связанных с производством продуктов питания и продуктов микробного синтеза. Учитывая, что микроскоп служит важнейшим орудием контроля в пищевой промышленности – знакомство с устройством оптического микроскопа и техникой микроскопирования является одним из основных практических навыков, которым должны овладеть бакалавры в курсе лабораторных занятий по микробиологии. Первые научные описания микроорганизмов принадлежат голландскому исследователю Антонию Левенгуку (1632-1727). Он применил для исследования простой микроскоп, представлявший собой лупу, которая давала увеличение до 300 раз.
Английский физик и изобретатель Роберт Гук сконструировал в 1660 г. микроскоп, состоявший из двух линз: объективной и окулярной. В XVII в. русский академик Л. Эйлер разработал теоретические основы расчетов ахроматических объективов, свободных от хроматической и сферической аберраций, и в 1774 г. был изготовлен такой микроскоп. В 1827 году итальянский ученый Дон Амичи применил иммерсионный объектив. Работы немецкого физика Э. Аббе (1872) послужили основой для дальнейшего усовершенствования объективов и осветительных систем.
Таким образом, современный оптический микроскоп был сконструирован только в конце XIX века.
Устройство оптического микроскопа МБИ-1 (рис.1)
Биологический микроскоп (от греческих слов micros - малый, scopeo-смотрю) состоит из трех основных частей: механической, осветительной и оптической.
Механическая часть микроскопа включает штатив, тубус, револьвер, винты с зубчаткой для передвижения тубуса и осветительного аппарата и предметный столик.
Штатив состоит из 2-х частей - нижней ножки или подставки, дающей микроскопу устойчивость, и верхней - тубусодержателя, имеющей форму ручки, за которую держат микроскоп при переносе.
Тубус – зрительная труба микроскопа. Для удобства работы биологический микроскоп МБИ-1 имеет наклонное положение тубуса, что достигается при помощи призмы, которая находится между объективом и окуляром. Наклонный тубус позволяет проводить исследования сидя, причем предметный столик микроскопа всегда расположен горизонтально, что особенно удобно при рассматривании жидких препаратов и при работе с иммерсией.
В верхнюю часть тубуса вставляют сменные окуляры. К нижней части тубуса привинчен так называемый револьверный механизм.
Револьвер состоит из 2-х выпуклых пластинок: верхняя из них наглухо привинчена к тубусу, а нижняя может вращаться вокруг своей оси. Нижняя пластинка имеет гнезда (3 или 4), в которые ввинчиваются объективы.
При вращении этой пластинки любой из объективов может быть подведен под тубус; маленькая пружинка, защелкиваясь в свой паз, удерживает объектив в этом положении.
При установлении объектива на фокус тубус перемещается вдоль оптической оси микроскопа с помощью двух винтов.
Один из них – кремальер а или макрометрический винт служит для грубой наводки. При малом увеличении микроскопа пользуются только макрометрическим винтом. Другой винт дает очень небольшие перемещения тубуса и называется микрометрическим. Этот винт служит для точной установки объектива на фокус при использовании большого увеличения (объективы 40х и 90х). Полный поворот микрометрического винта перемещает тубус лишь на 0,1 мм, а так как барабан винта разделен на 50 делений, то поворот на одно деление перемещает тубус на 0,002 мм или 2 мкм/1 микрометр – 1/1000 мм/.
Рис. 1. Микроскоп:
1-объектив, 2- окуляр, 3- осветительное устройство, 4- тубус,
5- предметный столик, 6- макрометрический винт, 7- микрометрический винт
При вращении винтов по часовой стрелке тубус микроскопа опускается, а при вращении против часовой стрелки – поднимается вверх.
Микрометрический винт является одной из наиболее хрупких частей микроскопа, поэтому обращаться с ним нужно чрезвычайно осторожно.
Предметный столик микроскопа имеет круглую форму, прикреплен к штативу. В центре его имеется отверстие для прохождения лучей света, освещающих препарат при исследовании. На столике имеются 2 металлических зажима (клеммы), которые служат для закрепления препарата при микроскопировании. Столик перемещается в двух взаимно перпендикулярных направлениях при помощи 2-х винтов, находящихся справа и слева, что позволяет рассматривать препарат последовательно в разных местах.
Осветительная часть микроскопа представлена конденсором Аббе, который состоит из нескольких линз, закрепленных в оправу и передвигающееся вверх и вниз при помощи винта. С помощью конденсора лучи, отраженные от источника света (зеркало или светильник) направляются через систему линз в объектив микроскопа и освещают исследуемый препарат.
При поднятии и опускании конденсора изменяется угол преломления лучей, вследствие чего изменяется степень освещенности препарата. Чем ниже положение конденсора, тем меньше освещение препарата и наоборот. При работе с иммерсионными объективами (90х) конденсор обычно поднимают до уровня предметного стекла, при работе с малыми и средними объективами конденсор несколько опускают.
На нижней поверхности конденсора укреплена ирис-диафрагма. Она состоит из нескольких металлических пластинок, произвольно сдвигаемых при помощи рычажка. Диафрагмой регулируют количество лучей, посылаемых на объект.
При малом увеличении (объектив 8х) диафрагму конденсора почти закрывают, пока не получится четкое изображение предмета.
Диафрагму суживают при ярком освещении.
Оптическая часть микроскопа состоит из объективов и окуляров.
Объективы являются наиболее важной и ценной частью микроскопа. Каждый объектив представляет сложную систему специально отшлифованных линз, помещенных в цилиндрическую оправу. На верхнем конце оправы имеется нарезка, при помощи которой объективы привинчиваются к револьверу.
Передняя линза, обращенная к предмету, называется фронтальной. Именно ею производится увеличение. Увеличительная способность объектива зависит от кривизны линзы. Чем больше кривизна фронтальной линзы, тем большее увеличение дает объектив. Биологические микроскопы МБИ-1 обычно снабжены тремя объективами с собственным увеличением 8х (восьмикратным), 40х (сорокакратным) и 90х (девяностократным), которые указываются на оправе объективов.
Другие линзы, следующие за фронтальной линзой объектива, называются коррекционными . Они служат для устранения оптических недостатков изображения.
Объективы 8х и 40х являются сухими системами, так как при работе с ними между препаратом и фронтальной линзой объектива находится воздух. Объектив 90-х называется иммерсионным так как при работе с ним между объективом и предметным стеклом наносят каплю иммерсионного масла.
Когда предмет рассматривается сухими системами, то световые лучи, идущие в объектив, проходят через неоднородные среды, различающиеся показателем преломления. Так, показатель преломления стекла п = 1,52, воздуха п = 1. Поэтому световые лучи, попадая из среды более плотной (стекла) в менее плотную (воздух) сильно отклоняются от вертикальной оси и не все попадают в объектив микроскопа, особенно при малых размерах линз. При пользовании иммерсионным объективом световые лучи проходят через однородную среду, т.к. показатель преломления иммерсионного (кедрового) масла п = 1,515. Поэтому в иммерсионной системе лучи проходят не преломляясь, не рассеиваясь и не изменяя своего направления, попадают в объектив. Ход лучей в сухой иммерсионной системе представлен на рис. 2.
Окуляры вставляются в верхний конец зрительной трубки (тубуса).
Каждый окуляр состоит из 2-х плосковыпуклых линз, заключенных в общую трубку. Линзы обращены выпуклой стороной к объективу и удалены друг от друга на расстояние, равное полусумме их фокусных расстояний. Верхняя линза называется глазной, нижняя - собирательной. Увеличение окуляра указывается на самом окуляре: 7х, 10х, 15х в микроскопе МБИ-1. Чем больше собственное увеличение окуляра, тем меньше фокусное расстояние его линз, тем он короче.
Окуляр увеличивает изображение, даваемое объективом, не прибавляя новых деталей структуры рассматриваемого предмета.
Для того чтобы определить общее увеличение микроскопа, нужно увеличение объектива умножить на увеличение окуляра. Так, например, если имеем окуляр 15х, а объектив - 40х, то рассматриваемые объекты будут увеличены в 600 раз (15х40).
А,Б – иммерсия
В,Г - сухая система
При микроскопировании имеет значение не только собственное увеличение микроскопа, но и его разрешающая способность,т.е. наименьшая видимая структура в микроскоп. Разрешающая способность зависит только от объектива, т.к. окуляр увеличивает лишь изображение даваемое объективом. Пределом видимости оптического микроскопа являются объекты не менее 0,2 мкм. В виду того, что многие бактерии имеют размеры клеток порядка 1-2 мкм, то детали строения их клеток лежат на границе разрешающей способности микроскопа.
Цель занятия: Познакомиться с принципами работы и использования приборов специальной микроскопии в исследовательских целях. Закрепить навык микроскопирования гистологического препарата.
¨ Задание:
1. Заполните таблицу 2, отметив основные виды микроскопии, их разновидности, кратко сформулируйте цели использования каждой разновидности.
Таблица 2
Методы и техника микроскопирования
1. Световая микроскопия. Применяются обычные световые микроскопы и их разновидности, в которых используются источники света с различными длинами волн. В световом микроскопе можно видеть не только отдельные клетки размером от 4 до 150 мкм, но и их внутриклеточные структуры – органеллы и включения. Для усиления контрастности микрообъектов применяют их окрашивание.
а) Ультрафиолетовая микроскопия. Используются более короткие ультрафиолетовые лучи с длинной волны около 0,2 мкм. Полученное невидимое глазом изображение преобразуется в видимое с помощью регистрации на фотопластинке или путем применения специальных устройств (люминесцентный экран, электронно-оптический преобразователь).
б) Флюоресцентная (люминесцентная) микроскопия. Суть метода заключается в том, что атомы и молекулы ряда веществ, поглощая коротковолновые лучи, переходят в возбужденное состояние. Обратный переход из возбужденного состояния в нормальное происходит с испусканием света, но с большей длиной волны. Применяются ртутные и ксеоновые лампы сверхвысокого давления, обладающие высокой яркостью в области ближних ультрафиолетовых и сине-фиолетовых лучей. Любая клетка живого организма обладает собственной флюоросценцией (часто довольно слабой).
Различают:
Первичная флюоресценция – обладают серотонин, катехоламины (адреналин и норадреналин), содержащиеся в нервных, тучных и других клетках, после фиксации тканей в парах формальдегида (метод Фалька).
Вторичная флюоресценция возникает при обработке препаратов специальными красителями – флюорохромами .
в) Фазово-контрастная микроскопия. Этот методслужит для получения контрастных изображений прозрачных и бесцветных живых объектов, невидимых при обычных методах микроскопирования. Для этого неокрашенные структуры помещают в кольцевую диафрагму, помещаемую в конденсоре, и фазовой пластинки, находящейся в объективе. Такая конструкция оптики дает возможность преобразовать не воспринимаемы глазом фазовые изменения прошедшего через неокрашенный препарат света в изменение его амплитуды, т.е. яркости получаемого изображения.
г) Микроскопия в темном поле. Достигает объективатолько свет, который дает дифракцию структур в препарате. В микроскопе есть специальный конденсор, который освещает препарат строго косым светом. Таким образом, поле выглядит темным, а мелкие частицы в препарате отражают свет, который далее попадает в объектив. Этот метод используется для изучения живых объектов, например зерен серебра, которые выглядят светлыми на темном поле. В клинике его применяют для изучения кристаллов в моче (мочевая кислота, оксалаты), для демонстрации спирохет и т.д.
д) Интерференционная микроскопия. Используется дифференциальный интерференционный микроскоп (с оптикой Номарского), который используют для изучения рельефа поверхности клеток и других биологических объектов.
В этом микроскопе пучок света от осветителя разделяется на два потока: один проходит через объект и изменяет по фазе колебания, второй идет, минуя объект. В призмах объектива оба пучка соединяются и интерферируют между собой. В результате строится изображение, в котором участки микрообъекта разной толщины и плотности различаются по степени контрастности. Проведя количественную оценку изменений, определяют концентрацию и массу сухого вещества.
Преимущество такой микроскопии является возможность наблюдать клетки в процессе движения и митоза. При этом регистрация движения клеток может производиться с помощью покадровой микрокиносъемки.
е) Темнопольный микроскоп применяется для получения изображений прозрачных живых объектов. Образец в нем рассматривается при столь «косом» освещении, что прямой свет не имеет возможности попасть в объектив. Изображение формируется светом, дифрагированным на объекте, и в результате объект выглядит очень светлым на темном фоне (с очень большим контрастом).
2. Поляризационная микроскопия. Поляризационный микроскоп является модификацией светового микроскопа, в котором установлены два поляризационных фильтра – первый (поляризатор) между пучком света и объективом, а второй (анализатор) между линзой объектива и глазом. Оба фильтра могут вращаться, изменяя направления пучка света. Структуры, содержащие продольно ориентированные молекулы (коллаген, микротрубочки, микрофиламенты), и кристаллические структуры (в Лейдига – гландулоциты яичка) при изменении оси вращения проявляются как светящиеся. Способность кристаллов или паракристаллических образований к раздвоению световой волны на обыкновенную и перпендикулярную к ней называется двойным лучепреломлением. Такой способностью обладают фибриллы поперечно-полосатых мышц.
3. Электронная микроскопия. Рассматривая характеристики светового микроскопа, можно убедиться, что единственным путем увеличения разрешения оптической системы будет использование источника освещения, испускающего волны с наименьшей длиной. Таким источником может быть раскаленная нить, которая в электрическом поле выбрасывает поток электронов, последний можно фокусировать, пропуская через магнитное поле. Это послужило основой для создания электронного микроскопа, в котором уже сейчас достигнуто разрешение в 0,1 нм. По принципу конструкции электронный микроскоп очень сходен с оптическим: в нем есть источник освещения (катод электронной пушки), конденсорная система (конденсорная магнитная линза), объектив (объективная магнитная линза), окуляр (проекционные магнитные линзы), только вместо сетчатки глаза электроны попадают на люминесцирующий экран или на фотопластинку. В электронном микроскопе используется поток электронов, с более короткими, чем в световом микроскопе, длинами волн. Разрешаемое расстояние в 100 000 раз меньше, чем в световом микроскопе. В современных электронных микроскопах разрешаемое расстояние составляет около 0,1-0,7 нм.
В настоящее время используются трансмиссионные и сканирующие электронные микроскопы, которые имеют большую глубину резкости, широкий диапазон непрерывного изменения увеличения (от 10-ков до 10-ков тысяч раз) и высокая разрешающая способность.
2. Рассмотрите строение светового микроскопа. Повторите правила работы с ним.
Работа с микроскопом . Устройство типичного биологического микроскопа (рис.1). Штативная подставка выполняется в виде тяжелой отливки. К ней на шарнире прикреплен тубусодержатель, несущий все остальные части микроскопа.
С помощью тубуса, в который вмонтированы линзовые системы, можно перемещать их относительно образца для фокусировки. На нижнем конце тубуса расположен объектив.
Как правило, микроскоп снабжен несколькими объективами разного увеличения на револьверной головке, которая позволяет устанавливать их в рабочее положение на оптической оси. При исследовании образца оператор обычно начинает с объектива, который имеет наименьшее увеличение и наиболее широкое поле зрения, находит интересующие его детали, после чего рассматривает их, пользуясь объективом с большим увеличением.
Окуляр вмонтирован в конец выдвижного держателя, при помощи которого можно при необходимости изменять длину тубуса. Передвигая вверх и вниз весь тубус с объективом и окуляром, микроскоп наводится на резкость.
В качестве образца обычно берется очень тонкий прозрачный слой или срез, который кладут на стеклянную пластинку прямоугольной формы, называемую предметным стеклом, а сверху накрывают более тонкой стеклянной пластинкой меньших размеров, которая называется покровным стеклом. Чтобы увеличить контраст, образец часто окрашивают химическими веществами.
Предметное стекло кладут на предметный столик таким образом, чтобы образец находился над центральным отверстием столика. Столик, как правило, бывает снабжен механизмом для плавного и точного перемещения образца в поле зрения.
Третья система линз – конденсор – концентрирует свет на образце. Держатель конденсоров, которых может быть несколько, находится под предметным столиком. Здесь же расположена ирисовая диафрагма для регулировки апертуры. Еще ниже находится осветительное зеркало, устанавливаемое в универсальном шарнире. За счет того, что зеркало отбрасывает свет лампы на образец оптическая система микроскопа и создает видимое изображение.
Рис. 1. Микроскоп для биологических исследований.
А-общий вид: 1 - основание; 2 – тубусодержатель; 3 – тубус; 4 – коробка механизма микроподачи; 5 – револьверное устройство; 6 – предметный столик; 7 - макрометрический винт; 8 – микрометрический винт; 9 – винт конденсора; 10 – окуляр; 11 – объективы; 12 – конденсор с ирисовой диафрагмой; 13 – зеркало; Б – объективы малого (а), большого (б) и иммерсионного (в) увеличения.
3. Рассмотрите микропрепараты (Таблица 3), зарисуйте, подпишите. Укажите тип красителя и увеличение.
Таблица 3
Препараты тканей с разным окрашиванием
